Брой 3/2017
Д. Дюлгерова – Николова, Л. Велева, И. Бочев, Р. Петкова, Т. Милачич
Медицински комплекс „Д-р Щерев“ – София
Субфертилитетът е състояние, което в световен мащаб засяга повече от 70 млн двойки в репродуктивна възраст. В България се счита, че те са над 250 000. Около 30% от безплодието се дължи на мъжки фактор – субфертилитет или стерилитет, свързан със структурни изменения на репродуктивния тракт и/или с нарушения в параметрите на семенната течност.
Андрологичните лаборатории разполагат с разнообразни методи за анализ, оценка и обработка на мъжките гамети, като всеки от тях има определена клинична стойност при диагностиката и прецизиране лечението на инфертилитет.
1. Спермограма
Спермалният анализ (спермограма) е стандартен лабораторен тест, който дава основна информация за функционирането на сперматогенезата, проходимостта на семенните канали и секреторната активност на половите жлези. Това е и първото изследване, което обикновено се назначава на мъже при двойки с репродуктивни неуспехи. За да бъде акуратен резултатът от спермограмата, е необходимо да се спазват определени изисквания както от страна на пациента, така и от извършващите го специалисти. Препоръките и за двете страни са подробно разписани в периодично издавано от Световната Здравна Организация (СЗО) лабораторно ръководство (Manual on Basic Semen Analysis).
Приемането на последната, пета актуализация на Ръководството за провеждане на семинологичен анализ (СЗО, 2010) е широко оспорвано от много европейски андрологични лаборатории, като не липсват и противоречиви коментари в специализираната литература, поради занижените референтни стойности на основни семинологични показатели.
Въпреки това, насоките към лабораторията за провеждане на семенен анализ остават непроменени и следват в две направления:
1. макроскопско изследване – определя се времето за втечняване на пробата, обема, вискозитета, цвета и pH на еякулата.
2. микроскопско изследване – установява се наличието на аглутинация, семинални левкоцити, незрели клетки на сперматогенезата, епителни клетки, бактерии и др. Следва определяне на общия брой на сперматозоидите и класифицирането им по подвижност в три групи – прогресивно подвижни (нормокинетични), непрогресивно подвижни (хипокинетични) и неподвижни (акинетични). Тази количествена оценка е съществена при поставяне на заключението на спермограмата, а в случаите на асистирана репродукция (АРТ, асистирани репродуктивни техники) може да бъде предпоставка за специфики в протокола за селективна обработка на еякулата.
В средата на 80-те години на ХХ-ти век в лабораторната практика навлизат компютърните системи за спермален анализ (CASA). С тях, освен конвенционалните семенни показатели, може да се определят още кинетиката и други детайли в движението на мъжките гамети. Трябва да се отбележи обаче, че работата с такъв софтуер е много специфична и изисква добро познаване на специализираната литература за интерпретиране на резултатите.
Известно е, че изследваните параметри при спермограмата са зависими от редица променливи фактори като периода на полово въздържание (Tyler et al., 1982; De Jonge et al., 2004), активността на акцесорните жлези (Eliasson, 2003), големината на тестисите (Holstein et al., 2003, Andersen et al., 2000). и др. Това обяснява интраиндивидуалните вариации в тези показатели и необходимостта от две или три проби (с интервал най-малко седем дни, за период от три месеца), преди да се направи заключение за качеството на спермата на един мъж. Нещо повече, поради значителното припокриване на резултатите от спермограмите при мъже с доказани оплодителни качества на сперматозоидите и такива с инфертилитет (Barratt et al, 1988; Barratt, 1995), не е коректно тестът да се приема като тест за фертилност.
Въпреки противоречивата си клинична стойност, семенният анализ е рутинен в андрологичните лаборатории. Той е важен носител на информация при диагностициране на ретроградна еякулация и Cryptozoospermia (сперматозоиди се откриват след центрофугиране на еякулата), като може да бъде и маркер за ранното откриване на различни патологии на мъжката репродуктивна система. Чрез спермограмата може да се следят и резултатите от лечението на бактериални и други инфекции. Във всички случаи е препоръчително изследването да се консултира със специалист – андролог.
2. Морфология на сперматозоидите
Интересът към морфологията на сперматозоида като маркер за фертилизационния му потенциал, датира от началото на XX-ти век, когато е прието схващането, че семенната течност съдържа едновременно нормални сперматозоиди и анормални форми (Menkveld, 1996). Оттогава започват да се търсят критерии за „нормалност” на мъжките гамети и да се формират различни класификации.
Днес, в андрологичните лаборатории, анализът на структурата на сперматозоидите се прави преимуществено по стриктните критерии на Tygerberg, по-често цитирани като стриктните критерии на Крюгер (Kruger’s strict criteria). Описанието, което тези критерии дават за морфологично нормален сперматозоид се основава на морфологията на сперматозоиди, открити след полов акт във вътрешната част на цервикалния канал. От 1992 г., изследването на морфологията на сперматозоидите по стриктните критерии на Крюгер се препоръчва и от СЗО.
Съгласно горецитираните критерии, резултатът от морфологичната оценка на една семенна проба се поставя след анализ на не по-малко от 200 сперматозоида, които се наблюдават за дефекти в главичката, шийката/средната част, опашката и наличие на цитоплазматични остатъци с определен размер. Предиктивната стойност на изследването Крюгер определя спрямо процента оплодени яйцеклетки при In Vitro Fertilization (IVF) и дефинира в три референтни групи (Kruger et al., 1986, 1988): при ≥15% морфологично нормални сперматозоиди – нормална прогностична оценка, от 5 до 14% – добра прогностична оценка и при ≤4% – лоша прогностична оценка. Тази класификация е актуална и към днешна дата, като някои лаборатории, оценяващи по последните критерии на СЗО, приемат 3% за долна гранична стойност.
Етиологията за дефектите в структурата на мъжките гамети може да е генетична, следствие от различни фактори на средата или прием на медикаменти (Menkveld, 2010). Генетично детерминирани малформации са глобозооспермията, синдромът на късите опашки, малките (микроцефалия) и големи главички (макроцефалия), синдромът на неподвижните опашки (Kartagener syndrome) и др. Тези състояния се изследват внимателно и изискват многопрофилна консултация, особено при желание на носителя да се реализира като генетичен баща. Във всички останали случаи, при които има висок процент на морфологично анормални сперматозоиди, е желателно пациентът да бъде изследван и консултиран от специалист-андролог.
Според някои автори, морфологичните малформации на сперматозоидите са свързани с висока ДНК-фрагментация (Gandini et al., 2000), повишена честота на структурни хромозомни аберации (Lee et al., 1996), незрял хроматин (Dadoune et al., 1988) и анеуплоидии (Devillard et al., 2002; Martin et al., 2003). Това е причината към морфологичен анализ да бъдат насочвани основно пациенти с репродуктивни неуспехи повече от 12 месеца, идиопатичен стерилитет, а по преценка на лекаря и такива с ранни спонтанни аборти. За мъжете в двойки с предстояща АРТ процедура има задължителен характер, защото резултатите от него са предпоставка за допълнителни изследвания и прилагане на различни техники при селекцията на гаметите.
3. HBA – sperm – hialuronan binding assay
Представлява готов тест за оценка зрелостта на сперматозоидите и способността им за рецептор-специфично прикрепяне към повърхността на яйцеклетка (взаимодействие с хиалуронова киселина). Базира се на проучвания, според които зрели сперматозоиди с интактна акрозома, добра морфология и по-нисък процент ДНК-фрагментация проявяват прикрепяемост във висок процент (Huszar et al., 2003).
Счита се, че НВА е полезен тест, но само в допълнение на стандартния семенен анализ, оценяващ концентрация, подвижност и морфология на сперматозоидите. Във връзка с получените от НВА резултати може да се прецизира прилагания метод при предстояща ин витро процедура – класическа IVF процедура, Intacytoplasmic Sperm Injection (ICSI), както и да се прецени възможността за лечение чрез по-неинвазивни АРТ, а именно автоложна интраутеринна инсеминация.
Тестът е приложим и има информативна стойност при пациенти с нормална или с леки отклонения спермограма.
4. MAR – mixed agglutination reaction
Един от тестовете за детекция на антиспермални антитела (АСА), прилаган в андрологичната лаборатория, е MAR тестът. АСА се образуват при нарушаване на кръвно-тестисната бариера и водят до имобилизиране и аглутиниране на гаметите, като намаляват мотилитета им и затрудняват проникването през цервикалния мукус. Наличието на АСА може да доведе до преждевременна акрозомна реакция и намалена способност на сперматозоидите да се свързват към zona pellucida (Naz et al., 1994). АСА се откриват в приблизително 10% от инфертилните мъже, сравнено с по-малко от 1% от фертилните.
MAR тестът, ползван в андрологичната практика, представлява търговски диагностичен кит за откриване на АСА от клас IgG (имуноглобулин) в семенна течност, цервикален мукус или серум (на мъжа и на жената). Тестът е евтин, лесен и високочувствителен.
Директният MAR тест е бърз метод за детекция на АСА при мъжки репродуктивни клетки, не изисква предварителна сепарация на гаметите и може да се прилага на проби с ниска концентрация на прогресивно подвижни сперматозоиди (Rasanen et al., 1994).
При индиректния метод обработени гамети се инкубират с инактивиран серум. Резултатите отчитат наличието на АСА в серума (Bronson et al., 1994).
Индикации за провеждане на теста са: идиопатичен стерилитет, наличие на аглутинати в семенната течност, тестикуларна торзия, крипторхизъм, травма на тестисите, варикоцеле.
Чрез диагностициране на мъжкия имунологичен субфертилитет може да се прецизира правилното поведение при лечение на инфертилна двойка. Наличието на висок процент АСА е предпоставка за прилагане на АРТ – автоложна интраутеринна инсеминация, класическa IVF или ICSI процедури.
5. Изследване на ДНК – фрагментация
Един от най-модерните тестове в андрологичната лаборатория е оценката на ДНК фрагментацията на сперматозоидите. ДНК на мъжките гамети е високо компактизирана. Няколко фактора могат да доведат до накъсване на ДНК веригата: апоптоза (програмирана клетъчна смърт) на репродуктивните клетки по време на сперматогенезата или при преминаването им през репродуктивния тракт; неправилна кондензация на хроматина по време на матурацията на мъжките гамети; оксидативен стрес, причинен от действието на ендогенни и екзогенни кислородни радикали (ROS) (Wright et al., 2014). Високият процент на ДНК фрагментация на мъжките гамети се асоциира с по-трудно постигане на бременност както по естествен път (Spano et al., 2000), така и чрез прилагане на АРТ (Benchaib et al., 2003). Нарушенията в цeлостта на ДНК имат негативен ефект върху ранното ембрионално развитие (Morris et al., 2002). Редица проучвания сочат, че високият процент увреждане на спермалната ДНК корелира с нисък процент оплодени яйцеклетки след IVF/ICSI, арест в развитието на ембрионите и повишен риск от спонтанен аборт (Benchaib et al., 2003; Zinni et al., 2008; Robinson et al., 2012).
Изследването на ДНК фрагментацията на сперматозоиди има важна диагностична и прогностична стойност при оценка на мъжкия инфертилитет. В лабораторната практика се прилагат няколко метода за определяне процента сперматозоиди с фрагментирана ДНК- SpermComet, TUNEL, Sperm Chromatin Structure Аssay и HALO (Sperm Chromatin Dispersion) тест. Предимствата на HALO теста пред другите методи са, че е стандартизиран, финансово достъпен, не изисква специална апаратура и получените резултати са лесни за интерпретация.
Основни индикации за прилагане на теста са: идиопатичен стерилитет, няколко неуспешни IVF/ICSI опити, лошо качество на ембрионите от предходни IVF/ICSI цикли, повтарящи се спонтанни аборти, варикоцеле, предшестваща химио/лъчетерапия, възраст на мъжа над 45 години (Ombelet et al., 1997).
Във връзка с получените резултати може да се приложат допълнителни към стандартните методи за обработка на сперматозоиди техники. Като маркер, стойностите на HALO теста могат да варират след прилагане на медикаментозно лечение или след промяна в стила на живот. Пациенти с потвърдени високи нива на ДНК фрагментация могат да бъдат консултирани за донорски програми.
6. Отстраняване на сперматозоиди с увредена ДНК чрез магнитно-активирано клетъчно сортиране
Магнитно-активираното клетъчно сортиране (MACS) е лабораторна техника за разделяне на клетъчни популации на базата на техни специфични белези. Разновидност на MACS успешно се прилага за отстраняване от еякулата на апоптотични сперматозоиди с увредена ДНК. Генетичният интегритет на сперматозоидите е от съществено значение за нормалната ембриогенеза като е доказано, че високите нива на ДНК фрагментация при мъжките гамети са свързани както с понижена оплодителна способност, така и с невъзможността за развитие на жизнеспособен ембрион (Dirican, 2008).
Освен с фрагментиране на молекулите на ДНК, апоптоза при сперматозоидите се характеризира и със загуба на мембранния интегритет, съпътствано от екстернализация на фосфатидилсерин (ФС) от външната страна на плазмената мембрана.
Фосфатидилсеринът е фосфолипид, локализиран в цитоплазмения слой на биологичните мембрани при здрави клетки. При апоптоза ФС се транспортира от цитоплазмената повърхност към външния слой на плазмената мембрана като играе ролята на повърхностен маркер за апоптотични клетки. По такъв начин ФС става достъпен за протеина анексин-5, който е способен специфично и с висок афинитет да се свързва с него. Именно взаимодействието между ФС и анексин-5 позволява отдиференцирането на апоптотични сперматозоиди от тези с интактна плазмена мембрана (Gil, 2013).
MACS се базира на използването на синтетични биополимери (микрогранули) с магнитни свойства, към които по химичен път се прикрепва анексин-5. При добавяне на натоварените с анексин-5 микрогранули към клетъчната суспензия (семенната проба), те покриват повърхността на апоптотичните сперматозоиди в резултат на специфичното им свързване с екстернализирания ФС. Преминавайки през магнитно поле, формираните комплекси с абнормални сперматозоиди селективно се задържат, докато незасегнатите гамети се пропускат свободно. В резултат се получава клетъчна фракция, пречистена от наличието на апоптотични сперматозоиди.
Приложението на метода е препоръчително в следните случаи: при наличие на висок процент сперматозоиди с фрагментирана ДНК, установено чрез допълнителни тестове; повтарящи се спонтанни аборти с неизяснени причини; нисък процент оплождане и/или влошено качество на ембрионите след проведена АРТ процедура без индикации за отклонения от морфологичните показатели на яйцеклетките; при пациенти с варикоцеле.
7. Методи за добив на сперматозоиди чрез хирургическа намеса
Интрацитоплазменото инжектиране на сперматозоид и съществуващите хирургически методи, чрез които биха могли да се изолират сперматозоиди за целите на АРТ, се явяват единствена алтернатива за пациенти със стерилитет с тежък мъжки фактор (Azoospermia), така че да имат биологично свое поколение.
Azoospermia, като заключение от проведен семенен анализ, може да се дължи на обструкция на семепроводите или друга част от репродуктивната система (рак на тестисите, прекаран тежък възпалителен процес, вазектомия) и в еякулата не се наблюдават сперматозоиди (Обструктивна Azoospermia-OA). При редица генетични заболявания (напр. Cystic fibrosis, Klinefelter’s syndrome) също се установява липса на сперматозоиди при анализ на семенната течност (Не обструктивна Azoospermia-NOA).
Необходима е прецизна анамнеза – урологичен преглед, хормонални и генетични изследвания, в определени случаи пациентът може да премине курс на лечение с хормонални препарати, след което би могло да бъде насочен за някой или няколко от съществуващите методи за добив на сперматозоиди чрез хирургическа намеса:
- PESA: (percutaneous epididymal sperm aspiration – подкожна епидидимална аспирация на сперматозоиди)
- MESA: (microsurgical epididymal sperm aspiration – микрохирургична епидидимална аспирация на сперматозоиди)
- TESA: testicular sperm aspiration – тестикулярна аспирация на сперматозоиди
- TESE: testicular sperm extraction – тестикулярна екстракция на сперматозоиди
В общия случай, при мъже с ОА се наблюдава по-висок процент успеваемост както по отношение на добиването на репродуктивни клетки (45 до 73%) спрямо мъже с NOA – респективно 20 до 25%, така и при процента на оплодени яйцеклетки след ICSI (Omurtag et al., 2010).
Благодарение и в резултат от приложените техники могат да се добият сперматозоиди за целите на АРТ. Методите имат и значителна информативна стойност, особено при случаи, в които не се откриват зрели сперматозоиди, но се наблюдават герминативни клетки, което е индикация за наличие на протичащ процес на формиране на репродуктивни клетки (сперматогенеза).
8. HOST – Hypo-osmotic swelling test
Когато заключението от поне две спермограми е Asthenozoospermia с липса на прогресивно подвижни сперматозоиди (тип А и тип В), или вероятна Necrozoospermia, в андрологичната лаборатория може да се приложи тест за оценка на виталността на репродуктивните клетки. Съгласно законовите разпоредби за Асистирана репродукция (Наредба 28/20.06.2007), оплождането на яйцеклетки може да се извършва само с витални, обработени в сертифицирана андрологична лаборатория сперматозоиди. HOS тестът е въведен от Jeyendran et al. (1984 г.) и е единственият метод за оценка на виталност, включен в последното издание на СЗО (2010), при който клетките могат да бъдат използвани след тестуването им. Благодарение на теста, в комбинация с АРТ (ICSI), се дава възможност на мъже с неподвижни гамети да опитат да станат биологични родители.
В основата на изследването е способността на виталните гамети да поддържат осмотичен градиент, когато са изложени на хипо-осмотични условия. Клетъчната мембрана на гамети със запазен мембранен интегритет и нормална функционална активност пропуска вода, предизвиквайки морфологични изменения (раздуване) на опашките (Jeyendran et al., 1984).
HOS тестът е лесен, евтин, не изисква допълнително оборудване и би могъл да се прилага както при сперматозоиди, получени чрез еякулация, така и при гамети, добити чрез TESE (Sallam et al., 2005). Редица проучвания показват, че използването на HOSТ-позитивни гамети при АР води до увеличаване на процента оплодени яйцеклетки след ICSI (40% до 45%) и клинични бременности (30% до 40%), спрямо No-HOST групи (респективно 0% до 20% и 0% до 10%)( Casper et al., 1996; El-Nour et al., 2001).
В лабораторни условия и във връзка с предстояща ин витро процедура биха могли да се приложат допълнителни към стандартната обработка на сперматозоиди методи, които да стимулират техния мотилитет. При мъже с тежка Oligoasthenozoospermia, много тежка или тотална Asthenozoospermia третирането с пентоксифилин (метилксантинов алкалоид) не само повлиява процента прогресивно подвижни сперматозоиди, но и значително повишава процента оплодени яйцеклетки след ICSI- от 55,9% в нетретирана до 66.0% в третирана група (Kovacic et al., 2006). Подобни резултати се наблюдават и при третиране с пентоксифилин на сперматозоиди, добити чрез TESE (54.3% без стимулатор до 66.7% с пентоксифилин; Griveau et al., 2006).
Прилагането на изброените методи може да подобри изхода от АРТ процедури при пациенти с тежък мъжки субфертилитет. Мъже с тотална Asthenozoospermia или вероятна Necrozoospermia е задължително да направят генетична консултация преди започване на АР със собствени гамети.
9. MSOME – motile sperm organelle morphology examination
Наред с измененията в морфологията на сперматозоида, засягащи размерите и формата на главичката, състоянието на акрозомата, шийните дефекти, наличието на цитоплазматични остатъци, опашните дефекти, друг морфологичен дефект е и наличието на вакуоли в главичката на сперматозоида. Интерес представлява техния брой, големина и разположение, като според СЗО вакуолите се считат за морфологичен дефект, когато се наблюдават две вакуоли или когато те заемат повече от 20% от областта на главичката (WHO, 2010).
Приeто е, че големите вакуоли представляват морфологичен дефект, свързан с нарушени характеристики и физиологични функции на сперматозоидите, наличие на ДНК фрагментация и последващ вреден ефект върху ранното ембрионално развитие (Vanderzwalmen et al., 2008; Cassuto et al., 2009). Присъствието на вакуоли може да е предпоставка за появата на молекулни дефекти, които да нарушат компактизацията на хроматина по време на матурацията на мъжките репродуктивни клетки, което от своя страна би могло да направи сперматозоидната ДНК по-податлива към действието на ROS.
Въвеждането на новия, т.нар. анализ на органелната морфология на подвижни сперматозоиди Мotile Sperm Organelle Morphology Examination (MSOME), дава допълнителни възможности при селекцията на сперматозоиди за инжектиране при IMSI (Intracytoplasmic Morphologically selected Sperm Injection). Чрез него могат точно и прецизно да се анализират най-добрите сперматозоиди в реално време в зависимост от тяхната подвижност, морфологични и органелни характеристики. Разработен през 2001 г. от екипа на професор Бартов от Израел (Bartoov et al. 2001), той използва инвертен светлинен микроскоп, снабден с оптична система и дигитална камера за постигане на увеличение до над шест хиляди пъти, много по-голямо от стандартно използваните (200×) или (400×) при ICSI (Bartoov et al., 2002). Така става възможно да се избере най-подходящия в морфологично отношение сперматозоид, за да се осъществи процеса на оплождане и също така да се подобри развитието на ембрионите при двойки, при които мъжкият фактор е основната причина за неуспех от проведени АРТ процедури.
През годините, в които се прилага MSOME като метод за селекция на гамети при ICSI, е установено, че той не повишава успеваемостта от АРТ при жени в напреднала репродуктивна възраст (над 37 години), както и при изчерпан яйчников резерв. Не може да се прилага и при много тежък мъжки фактор, когато има единични подвижни сперматозоиди (под 1 млн.).
Основни индикации за прилагането на този допълнителен метод за селекция на мъжките репродуктивни клетки са: нисък процент на оплождане (20-30%) в предходен ин витро опит; лоша морфология на сперматозоидите (под 4%) и висок процент на ДНК фрагментация на сперматозоидите; липса или малък % (0-20%) достигнали до стадий бластоцист ембриони при предишен ЕТ (трансфер на ембриони) на ден 5.
10. Криоконсервация и криосъхранение на сперматозоиди
Сперматозоидите са първите успешно криоконсервирани клетки на бозайници. Огромен принос в тази област имат откритията на Polge и колеги за криопротективния ефект на глицерола (Polge et al., 1949), а по-късно и на Sherman за съхранението на спермата в течен азот (Sherman, 1963).
Днес, в практиката се използват два метода за криоконсервация – бавно замразяване и по-рядко – витрификация. Основен недостатък на бавното замразяване е т.нар. биологична преживяемост на сперматозоидите (БП, процентът на добре подвижни сперматозоиди след размразяване; CSR – cryosurvival rate), която при някои пациенти с добри изходни показатели на спермограмата е много ниска. В тази връзка е препоръчително да се съставя индивидуален протокол в съответствие с характеристиките на пробата в деня на замразяване, за да може да се оптимизират съотношението криопротектор/сперма и времето на отделните температурни стъпки. С не по-малка важност е и начина на размразяване и последващата обработка на материала.
Криоконсервацията на сперматозоиди се препоръчва преди вазектомия, лъче – и химиотерапия. В по-общ план е опция и за мъже, изложени на вредни фактори в професионалната среда (напр. химични канцерогени, радиоактивни лъчения и др.), с желание да се реализират като родители в по-късен етап от живота си. В асистираната репродукция, замразяването на семенна течност се практикува често при пациенти с големи вариации в спермограмите, при наличие на сперматозоиди след хирургически микротехники, както и в случаи, при които партньорът няма възможност да отдели свеж материал в деня на съответната манипулация (най-често поради психологически причини или работен ангажимент). Тук е мястото да се отбележи, че съгласно Наредба 28 от 2007 г. на МЗ за дейности по АРТ, преди да бъде замразена семенната течност, пациентът е длъжен да представи резултати от микробиологично изследване на еякулат и тестуване за ХИВ, хепатит B, хепатит С и сифилис. По отношение на срока на съхранение на собствени сперматозоиди, законодателят препоръчва същия да не надвишава 5 години.
Криобанкирането на мъжки гамети има и друг важен аспект и това са донорските спермални криобанки. Всяка година броят на пациентите, нуждаещи се от донорски сперматозоиди, нараства. Сред тях са не само самотни жени, но и двойки, при които мъжът е с доказан тежък субфертилитет. Информация, касаеща законовата регулация за ползването на донорски сперматозоиди, може да бъде потърсена в специализираните лечебни заведения.
Андрологичната лаборатория към Медицински комплекс „Д-р Щерев“ покрива най-важните и съвременни методи за спермален анализ, които са клинично значими и резултатите от тях намират приложение при определяне лечението на пациентите.
