Брой 12/2017
Доц. д-р Я. Манолова, д.м., д-р М. Бояджиева, ас. д-р Д. Бояджиев, ас. д-р М. Маринов, проф. д-р Х. Групчева, д.м.н.
Катедра по очни болести и зрителни науки, МУ – Варна
Специализирана Болница по Очни болести за активно лечение – Варна
Предната очна повърхност (ПОП) е една от най-динамичните и чувствителни структури в човешкото тяло. Тя е изложена на непрекъснатото въздействие на околната среда, а нейното здраве е от значение за правилното функциониране на органа на зрението. Основната ѝ функция е от една страна осигуряване на гладка, овлажнена, рефрактивна повърхност с комфортни мигателни движения при минимална механична травма, а от друга – осигуряване на стабилна бариера срещу микробна инвазия и въздействието на обкръжаващата среда, както и осигуряване на трофика и защита на клетките на очната повърхност. Окото притежава мощни протективни механизми като клепачи, слъзен филм, роговичен и конюнктивален епител и субмукозна аденоидна тъкан (фиг.1). В зоната на лимба, която се намира на прехода между роговицата и склерата, се намират стволови клетки, благодарение на които роговичният епител се самообновява на всеки седем до четиринадесет дни.
Въпреки това при трудно лечими заболявания не малка част от пациентите развиват болест на предната очна повърхност, която е свързана с прогресия на възпалителните процеси, васкуларизация и в крайните стадии развитие на цикатризация, която води до намаляване на зрението. В повечето развиващи се страни заболяванията на ПОП са втората водеща причина за слепота, след катарактата (1). В последните години с развитието и израстването на регенеративната медицина се откриха нови възможности за лечение на тежките, неповлияващи се от медикаментозна терапия и хронични заболяванията на ПОП. Едно от направленията на регенеративната медицина е създаване или използване на естествени матриксни тъкани за възстановяване и/или стимулиране функцията на тъкани, увредени или загубени, вследствие възраст, болестни процеси, травми или вродени дефекти чрез използване идеите на тъканното инженерство и молекулярната биология. Едно от най-важните условия е използването на лесно интегрираща се матрица, която да осигури отлична среда за растеж, миграция и диференциация на клетките. Преди около 100 години тези качества са открити в една от най-устойчивите ембрионални тъкани – амниотичната мембрана (АМ). Множество проучвания доказват, че тя е кандидат с ненадминат потенциал за тъканен инженеринг в регенеративната медицина и клетъчната терапия.
АМ е най-вътрешният слой на плацентата, разположен в непосредствена близост до плода и отговарящ за хомеостазата на амниотичната течност. Хистологично тя е аваскуларна, трислойна мембрана, която се състои от епителен монослой, базална мембрана и строма. Най-общо АМ се състои от три типа структури:
• Структурен колаген и екстрацелуларен матрикс;
• Биологично активни клетки:
◦ eпителни;
◦ стволови епителни клетки;
◦ мезенхимални фибробласти;
• Голям брой регенеративни молекули;
Двата клетъчни типа са с различен ембрионален произход и показват някои характеристики на стволовите клетки. Епителните клетки са получени от ембрионалната ектодерма, докато мезенхимaлните стромални клетки водят началото си от ембрионалната мезодерма. И двете популации имат сходен имунен фенотип и мултипотенциал за диференциация in vivo, в основните мезодермални линии (2). Базалната мембрана е предстaвена предимно от колаген тип I, III, IV, V и VII, открити и в базалните мембрани на роговицата и конюнктивата, в допълнение с фибронектин и ламинин и големи количества протеогликани и хепарин сулфат. Тези компоненти са налични и в стромалния матрикс на АМ. Базалната мембрана е една от най-дебелите мембрани в човешкото тяло и може да издържи на настоящите техники за съхранение (криосъхранение, лиофилизация и др.). АМ е устойчива на възпаление, реагира инертно в условията на гостоприемната тъкан. Притежава механични свойства като пропускливост, стабилност, еластичност и гъвкавост. Тя има и противовъзпалителни, антицикатрициални, антиангиогенни свойства и най-важното – подпомага епителизацията (3). Човешката АМ е имунологично привилегирована тъкан с наличието на множество растежни фактори (4) и клетъчно-сигнални способности (5), (6). Мембраната действа като биологична превръзка, като предпазва регенериращият епител от силите на триене породени от мигащото движения на клепачите, намалява болката, адхезирайки върху нервните окончания. Благодарение на високата си хидрофилност от една страна запазва влажността на ПОП, а от друга има добра кислородна пропускливост. Притежава антимикробни и антивирусни свойства, благодарение на механични и биологични фактори. Тя е селективно пропусклива, което я прави добър заместител на антифибротичните агенти във филтрационната антиглаукомна хирургия (7).
Съществуват различни техники за трансплантация на АМ в офталмологията в зависимост от целта на оперативната интервенция. Тя се използва като пълнител при дълбоки дефекти на роговицата, като покритие на очната повърхност, с цел протекция от заобикалящите я вредни фактори, или като матрикс за растеж на епителни и стволови клетки.
Описаните характеристики на амниотичната мембрана я правят приложима и в други клонове на медицината като дерматологията, пластичната и коремна хирургия. Тя се оказа ефективна платформа за регенерация на периферни нерви, стволови клетки, хондроцити (като носеща матрица за регенерация на хрущял). Когато епителните и мезенхималните клетки се посеят на клетъчно скеле, създадено от АМ, клетките се свързват силно и имат способността да проникват в порестата структура на амниотичното скеле. Тези експерименти показват, обещаващ нов подход за възстановяване на преждевременно разкъсани околоплодни мембрани. Докладвано e отглеждането на ендотелни клетки върху AM с иновативен потенциал за съдов инженеринг.
Първите опити за трансплантация на АМ в България са направени от Проф. Н. Константинов през 60-те години на миналия век. Тогава се е вземала „прясна“ АМ от плацентата при раждане по нормален път. Не се е правила проверка за инфекциозни причинители. Резултатите са публикувани основно в „Съветската“ литература и показват намаляване на болката и ускоряване на зарастването след изгаряне. Следва период на „забравяне“ на тази методика. През 2005 г. година нашият екип под ръководството на проф. Групчева на база на позитивния си опит от Университета в Окланд, Нова Зеландия и сътрудничеството на Институт Пирогов, осъществи първата в България трансплантация на АМ, отговаряща на Европейските стандарти. Днес АМ се използва успешно за лечение на редица заболявания на предната очната повърхност. Намира приложение при различни язвени дефекти (9), (10), (11), токсична кератопатия, за лечение на микробни кератити, поясовиден кератит, булозна кератопатия, след усложнения от фоторефрактивна хирургия, crosslinking и химични изгаряния (12), (13), при десцеметоцеле и перфорация на роговицата. На фиг.4 е представен пациент на 36 години с токсична кератопатия, причинена от злоупотеба с Alcain 0.5%, постъпил със субективни оплаквания от болка, загуба на зрение, фотофобия и сълзене с давност 20 дни и тежка обективна находка – двустранно дълбоки пръстеновидни инфилтрати на роговицата в съчетание с floppy eyelid синдром и блефарохалаза. По време на пролежаването се извършиха неколкократни трансплантации на амниотична мембрана (АМТ), за облекчаване на болката и подпомагане на реепителизацията. На втори етап от лечението се извърши комбинирана процедура: колагенов крослинкинг и АМТ.
Други показания за трансплантация на AМ включват реконструкция на очната повърхност като хирургия на конюнктивата при дефекти след отстраняване на големи лезии, птеригиуми (15), симблефарон, реконструктивна хирургия на форниксите, дефицит на стволови клетки на лимба, едновремeнно с трансплантация на стволови клетки (16) и др.
Със създаването на тъканни банки се откриха нови възможности за трансплантация на човешка АМ, обработена асептично при контролирани условия чрез използване на валидизирани методики, които възпрепятстват контаминацията или кръстосаната контаминация (от донор към донор) на обработваната тъкан. АМ, използвана за трансплантация, се взима по време на цезарово сечение, поради опасността от замърсяване от влагалищната флора по време на нормално раждане (фиг.5). Потенциален донор са всички бъдещи майки, желаещи да дарят плацентата по време на раждане и със серонегативни тестове за хепатит, СПИН, сифилис и др. Серологичните тестове при серонегативни лица се повтарят 3-6 месеца по-късно и се съхраняват 11 години. След установяването на потенциален донор, той се информира за начина на получаване на тъканта и за използването ѝ. Запазва се неговата анонимност, съгласно нормативните актове, касаещи донорството. Взетият материал след проверка и обработка по стандартизирани методики може да се използва след 6 месеца и има трайност 18 месеца, а ако се замрази и лиофилизира може да престои и години.
В България се използва криосъхранена АМ, предлагана от Тъканна банка към Институт Пирогов, Тъканна банка „Биорегенерация”, а от 2016 г. започна предлагането и на амниотична мембрана – АлоАМ на „Центъра за транслационна медицина и клетъчна терапия“ към МУ Варна. Центърът е разположен в УМБАЛ „Св. Марина”. Тъканната банка към Институт Пирогов предлага АМ в свободно състояние. Недостатък на този вид предлагане е, че мембраната трудно се разделя и трансплантира, поради трудното отдиференциране на различните повърхности. АМ от останалите две банки е криосъхранена и фиксирана към нитроцелулозна хартия, (фиг.6), като Биорегенерация предлага криосъхранен алографт в 85% глицерол с PBS, а АлоАМ на МУ-Варна е криосъхранен алографт в 50% глицерол и 50% хранителна среда – DMEM.
АМ е алотрансплантат с огромен терапевтичен потенциал. Тя е решение при много тежки заболявания на предната очна повърхност. Трансплантацията ѝ спасява пациентите от силни болки, помага на пациенти с тежки възпаления и изгаряния. Тя е доказано средство на избор при трудно лечими, рецидивиращи и тежки патологични промени на предния очен сегмент. Понякога е единственото решение, когато болният чака донор за трансплантация на роговица. Бъдещето на амниотичната мембрана е използването ѝ като матрикс за трансплантация на различни роговични клетъчни линии. Вероятно ще бъде възможно и използването на терапевтични лещи, постлани с АМ, което ще намали рисковете от използване на шев, хлабави шевове, интраоперативни хеморагии и постоперативен дискомфорт.
Библиография:
1. Oliva MS, Schottman T, Gulati M. Turning the tide of corneal blindness. Indian J Ophthalmol. 2012 Oct;60(5):423–7.
2. Wang Y, Zhao S. Vascular Biology of the Placenta. Morgan & Claypool Publishers; 2010. 99 p.
3. Silini AR, Cargnoni A, Magatti M, Pianta S, Parolini O. The Long Path of Human Placenta, and Its Derivatives, in Regenerative Medicine. Front Bioeng Biotechnol. 2015;3:162.
4. Koizumi NJ, Inatomi TJ, Sotozono CJ, Fullwood NJ, Quantock AJ, Kinoshita S. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res. 2000 Mar;20(3):173–7.
5. Schroeder A, Theiss C, Steuhl K-P, Meller K, Meller D. Effects of the human amniotic membrane on axonal outgrowth of dorsal root ganglia neurons in culture. Curr Eye Res. 2007 Sep;32(9):731–8.
6. Touhami A, Grueterich M, Tseng SCG. The role of NGF signaling in human limbal epithelium expanded by amniotic membrane culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002 Apr;43(4):987–94.
7. Seitz B, Resch MD, Schlötzer-Schrehardt U, Hofmann-Rummelt C, Sauer R, Kruse FE. Histopathology and ultrastructure of human corneas after amniotic membrane transplantation. Arch Ophthalmol Chic Ill 1960. 2006 Oct;124(10):1487–90.
8. Манолова. Трансплантация на амниотична мемебрана – логистика, хирургически техники и микроструктурен анализ на резултатите.
9. Fuchsluger T, Tuerkeli E, Westekemper H, Esser J, Steuhl K-P, Meller D. Rate of epithelialisation and re-operations in corneal ulcers treated with amniotic membrane transplantation combined with botulinum toxin-induced ptosis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol Albrecht Von Graefes Arch Für Klin Exp Ophthalmol. 2007 Jul;245(7):955–64.
10. Solomon A, Meller D, Prabhasawat P, John T, Espana EM, Steuhl K-P, et al. Amniotic membrane grafts for nontraumatic corneal perforations, descemetoceles, and deep ulcers. Ophthalmology. 2002 Apr;109(4):694–703.
11. Kruse FE, Rohrschneider K, Völcker HE. Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers. Ophthalmology. 1999 Aug;106(8):1504–1510; discussion 1511.
12. Kheirkhah A, Johnson DA, Paranjpe DR, Raju VK, Casas V, Tseng SCG. Temporary sutureless amniotic membrane patch for acute alkaline burns. Arch Ophthalmol Chic Ill 1960. 2008 Aug;126(8):1059–66.
13. Meller D, Pires RT, Mack RJ, Figueiredo F, Heiligenhaus A, Park WC, et al. Amniotic membrane transplantation for acute chemical or thermal burns. Ophthalmology. 2000 May;107(5):980–989; discussion 990.
14. Manolova Y., Boyadgieva M., Grupcheva C. Тоxic keratopathy as a result of abuse with topical anestetics and its treatment with amniotic membrane tranpsplantation and collagen crodd-linking – clinical case. International journal of innovative trends in engineering. 2017, issue 43, vol.27, No 1, p.15-22
15. Lee SB, Li DQ, Tan DT, Meller DC, Tseng SC. Suppression of TGF-beta signaling in both normal conjunctival fibroblasts and pterygial body fibroblasts by amniotic membrane. Curr Eye Res. 2000 Apr;20(4):325–34.
16. Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med. 2000 Jul 13;343(2):86–93.
