Влиянието на HPV върху карцинома на пениса

Брой 11/2005

Р. Симеонов, Б. Цингилев, В. Табаков, Кр. Нейков, Ст. Симеонов

Човешките папилома вируси са с размери приблизително 55 пт. Те съдържат двойноверижна ДНК и издържат на температура до 56 оС.Тъй като вирусите от тази група не могат да бъдат изолирани в тъканни култури, проучванията за структурата на отделните видове се ограничават само до тези типове, които могат да бъдат изолирани по естествен път, каквито са например BPV, HPV1 и CRPV.

Изследванията върху структурата на вирусите показват, че вирусният капсид е изграден от 72 капсомера, които са свързани помежду си, структурирани във формата на дванадесетостенник. Капсомерът съдържа пет еднакви молекулни протеини (най-вероятно от типа L1), които представляват приблизително 90 % от общия проте­ин на вируса. L1 протеините имат молекулярна маса 55 KD. По-малката белтъчна структура L2 има молекулярна маса около 75 KD. Позицията на L2 във вирусния капсид не е съвсем ясна, но нейният краен азотен участък показва, че се свързва с ДНК по специфичен начин, което пък от своя страна е показателно за ролята на L2 в образуването на HPV генома.

Папиломните вируси са в една група с папои полиовирусите, но са били обособени в отделна група HPV. Различните папиломни вируси се класифицират като „типове”, но тъй като са били определяни чрез генетични анализи, в литературата е прието да се обозначават като „генотипове”. Те не се класифицират серологично и затова терминът „серотип” е неуместен. Понастоящем всеки нов HPV геном се определи като нов HPV тип, ако нуклеотидната последователност в неговите Е6, Е7 и L1 гени (около 1/3 от генома) се различава повече от 10% от тези на предишния дефиниран тип. До 1994 г. са били известни 70 HPV типа, а сега са над 100-150 типа. Тези стотина типа се разпределят в 5 основни групи, определени по латинската азбука: А, В, С, D, Е. Най-голяма е зрупа А, включваща 44 типа HPV, които са фенотипно хетерозенни. Освен вирусите, които предизвикват предимно гениталии лезии, в тази гру­па се включват и вируси като HPV-2, които причиняват кожни брадавици. Към същата група се чис­ли и HPV-7, които често се изолира в т.нар. касапски брадавици. Трупа А включва също така и HPV16, HPV-31, HPV-33 и HPV-35, както и HPV-18, кои­то са най-честите групи вируси, свързани с карциноми на гениталиите. в същата попадат HPV6 и HPV-11, които предизвикват островърхи кондиломи, и друзи, които предизбикбат ларинзеални папиломи.

В основна група в се съдържат най-вече HPV типове, свързани с т.нар. epidermodysplasia verruciformis. Вирусни типове като HPV-5 и HPV8 се посочват като оснобни причинители, a HPV-3 и HPV-10 са изолирани предимно при плоски бра­давици.

Тените Е5, Е6 и Е7 кодират белтъчни субстра­ти, стимулиращи растежа. Свойствата на тези протеини се отнасят до мутазенните и канцерогенните възможности на вируса. Е6 протеините при някои от HPV вирусите се свързват с туморсупресор протеина Р53, предизвиквайки деградацията му, което довежда от своя страна до отпадане на Р53 свързания контрол на клетъчния цикъл. Също така Е6 може да потисне или да активира транскрипцията на различни промотери чрез взаимодействие с Р53 или чрез иницииращ транскрипцията основен комплекс (Lamberti et al., 1990; Desaintes et a!., 1992).

HPV E7 протеинът e бил разглеждан от Munger & Phelps, 1993 з. Същият протеин образува ком­плекс с туморсупресорния протеин при болни с ретинобластом и повлиява E2F (т.нар. транскрипшън фактор). От своя страна Е1 протеинът инициира репликацията във вирусния геном. Е2 пък оказва влияние върху регулацията на транскрип­цията и репликацията на HPV генома. Е4-протеинът е ангажиран в съзряването и освобождаването на вирусните частици.

Диагностични методи за различните HPV инфекции
1. Диагноза по морфолозични белези (основно са цитолозични и хистологични методики).
2. Откриване (изолиране) на HPV протеините в инфектираните тъкани.
3. Откриване на HPV геномна последователност чрез т.нар. ДНК амплификация.

Първи чрез PCR амплифицират вирусния геном Saiki et al. през 1988 г. Също така се използва и методът на директна хибридизация на гено­ма, където, за да се идентифицира геномът, не е необходима предварителна амплификация. До настоящия момент PCR амплификацията на гено­ма се смята за основен метод за диагностика на HPV в клинично проявени лезии.

4. Hybrid CaptureTM и ViraPapTM
Хибрид капчър не използва радиоактивни реа­генти, свързани с РНК, за разлика от вирапап.Той представлява денатурация на едноверижна ДНК, която влиза в реакция с А и в проби от РНК.

5. Southern blot hybridization test
При този тест се изискба да бъде пречистена клетъчната ДНК. Идентифицирането на HPV вирусите се вазира на размера на хибридизиращия фрагмент и интензитета на хибридизация.

Онкогенеза
Как HPV оназват потиснаицо влияние върху процесите на апоптозата и индуцират съответно малианена трансформация

Този процес обхваща възможностите за растеж на клетките при висока сатурация и концентра­ция на кислород, загуба на котактна инхибиция, намаляване необходимостта и потребностите от растежни фактори и създаването на условия за независим растеж.

HPV-16 и HPV-18 са показали в клетъчни култури на човешки кератиноцити, че притежават имортализираща активност. Тези клетъчни култури все още не са придобили малигнена характерис­тика. Настъпилите промени в диференциацията им са както при нискостепенна CIN. Други типове вируси като например HPV-6 и HPV-11 не притежа­ват имортализиращи или трансформиращи клет­ките в малигнена посока свойства. При по-задълбочен анализ е установено, че са необходими само протеини Е-6 и Е-7 за имортализация на човешки гениталии кератиноцити. При провежданите в тази насока опити е установено също така, че Е-7 може да функционира самостоятелно, когато е под контрола на силен промотер, а Е-6 е необ­ходим, когато Е-7 е под обичайния вирусен конт­рол. Така например Е-6 не е способен да имортализира самостоятелно (първично) човешки генитал­ии кератиноцити.

Функция на вирусния онкопротеин Е-7
Протеинът Е-7 блокира негативно регулацията на клетки от ретинобластом, свързвайки се с хипофосфорелирани ретинобластом ни гени и свързани с тях ретинобластомни протеини. Е-7 протеините на HPV-16 и HPV-18 свързват хипо­фосфорелирани те ретинобластомни супресорни гени с много по-голям афинитет от Е-7 протеи­ните на HPV-6 и HPV-11.

Функция на Е-6 протеина
Протеинът Е-6 на HPV-16 и HPV-18 разгражда по специфичен начин частично или напълно р53 туморсупресор гена. В обща популация полиморфизмът на кодон 72 на р53 ген предизвиква транс­локация или на аргинин, или на пролин. Едно проучване е показало, че Е-6 по-ефикасно разграж­да кодона на р53 ARG от р53 PRO. Някои авто­ри съобщават, че при бели жени, хомозиготни за ARG-алел, вероятността да развият рак на шийката на матката е 7 пъти по-голяма от тази при хетерозиготни индивиди. все пак това наблю­дение не се потвърждава от учени от Англия и Япония. Съвсем пресни наблюдения посочват Е6 протеина като виновник за активирането на ензима теломераза, предизвиквайки по този начин клетъчна трансформация с последваща клетъчна имортализация.

Активирането на теломеразата позволява на клетките да избегнат скъсените теломерични сигнали, които от своя страна предизвикват стареенето на самата клетка. Е-6 протеинът не може да прояви теломеразна активност без експресия на Е-7. Инфектирането с високо рискови HPV групи не е достатъчно само по себе си за възникване на малигнена трансформация. Освен него е необходимо излизане от контрол на имунната система, намаляване възможността за експресия на вирусния геном и натрупване на допълнителен генетичен материал. Клетъчният имунитет играв важна роля в онкогенезата при HPV инфекции. Имуносупресирани пациенти има далеч по-голяма вероятност да развият труднолекуващи се брадавици и са с по-голям риск да развият CIN. Не е отчетен отговор при така наречените цитотоксични лимфоцити при пациенти с HPV инфекция.

По-нови съобщения показват, че цитотоксичните лимфоцити (CTL) и техният отговор имат защитна функция срещу CiN. По отноше­ние на ролята на хуморалния имунитет при HPV инфекции засега проблемът все още стой открит. Ролята на HPV в патогенезата на урогениталните тумори за съжаление почива на противоречиви изводи. Като основна причина за тези затрудне­ния се посочва, че вирусите или не се култивират (изолират), или се култивират трудно на базата на клетъчни култури in vitro. HPV вирусите са спе­цифични за всеки гостоприемник и не са патоген­ни за други животни. Първоначалните съобщения за изолиране на HPV при урологични карциноми са се базирали на хистологични и урологични кри­терии, като например промени от цитологичен и хистологичен характер, представящи се като койлоцитоза, дискератоза и акантоза.

От тях койлоцитозата е най-често срещаният морфоло­гичен белег, който се характеризира с вакуололизация на цитоплазмата и ядрен плеоморфизъм. За диагностиката на HPV инфекциите са били използвани имунохистохимични техники, а също така и електронна микроскопия. Техники като ДНК хибридизация за момента се смятат за едни от найчувствителните методи и осигуряват значително по-надеждни изводи. Имуно in situ хибридизацията позволява прецизна клетъчна локализация на фрагменти от ДНК дори когато само няколко клетки са приютили части от ДНК на HPV вируси­те. Хибридизационната техника позволява също така типизиране на вируса. При клинични прояви това позволява да бъдат установявани по-честите HPV типове. Независимо от прецизността на тази молекулярна техника се съобщават раз­личии HPV вируси при онкологичните заболева­ния. Тези различия 6 резултатите се дължат найчесто на контаминация или фалшиво позитивен резултат, свързан с техниката, както е напри­мер при PCR.

HPV при карцинома на пениса
Плоскоклетъчният карцином на пениса е сравнително рядко заболяване и заема по-малко от 1 % от общата онкологична заболеваемост при възрастни. В Европа годишно се разболяват 1 на 100 000 мъже. Най-висока е заболеваемостта в седмото десетилетие. Развитието на карцино­ма на пениса най-вероятно е резултат от стъпаловидна верига от фактори, влияещи продължително време, най-често години. Ракът на пени­са е онкологично заболяване най-вероятно с мно­гофакторна генеза. Като етиологични фактори се посочват дългогодишна злоупотреба с тютюнопушене, лоша лична хигиена, високостепенни фимози и спад в локалния и общия имунитет.

За мъже, които са приемали дълго време медикаменти за лечение на псориазис и са били подложени на ултравиолетово облъчване по повод на това дерматолог и чно заболяване, се съобщава, че са с повишен риск за развитието на рак на пениса. Провеждането на циркумцизия при новородени момчета се смята за добър превантивен фактор срещу това заболяване. Като предпазващ момент се посочва и добрата лична хигиена. Резултатите от някои съвременни изследвания дават основание да се твърди, че HPV вирусите играят важна роля в патогенезата на рака на пениса. При рак на пениса различните автори посочват изолирани (диагностицирани) HPV вируси 8 15 до 80% от случайте. При съвсем пресни проучвания върху група от 156 пациенти се установява присъствие на HPV-ДИК при 42 болни с инвазивен рак на пениса, при 13 пациенти с кар­цинома in situ, 12 пациенти с интраепителиална неоплазия, при 3-ма с верукозна форма на карци­нома, при 25 случая с баланитис ксеротика облитеранс, 29 случая след циркумцизия 6 неонаталния период и при 32 случая на циркумцизия в зрелия период.

Подобно на карциномите на шийката на матката високорисковите субтипове HPV-16 и HPV-18 се свързват с рака на пениса. Генетични секвен­ции от HPV-16 са изолирани при 80-90% от слу­чайте с карцином на пениса, докато HPV-18 присъства само при 10% от случайте при това проучване.

При друго голямо проучване, проведено на територията на Франция върху 1000 мъже, чиито жени са имали доказани кондиломи, е бил проведен скри­нинг с цел обективизиране на начални симптоми на PIN. При 92 от изследваните 1000 мъже биопсиите са позитивни, а 93% са били PIN-позитивни. Онкогенни HPV са установени при 85 % от мъжете с първа степен PIN, 8 93% от тези с втора степен и при 10% от показалите трета степен на PIN. При това проучване не е установена ста­тистически значима разлика при мъжете с циркумцизия и без циркумцизия, докато при мъжете с PIN наличието на HPV е било почти повсемест­но. Случайте с PIN са били наблюдавани по-често при мъже без циркумцизия. Също така при мъже с имунокомпрометиран статус HPV инфекции се наблюдават значително по-често. При бъбречно трансплантирани болни, които са били третирани с имуносупресивни медикаменту се завелязва значително увеличение на плоскоклетъчните карциноми в ано-гениталната облает, включително и рак на пениса. В едно золямо проучване са били отчетени карциноми на ано-гениталната област при 65 болни от общо 2150 бъбречно трансплан­тирани, като лезиите са били наблюдавани предимно на четвъртата-петата година след трансплантацията.

Като преканцерози на рака на пениса се описват главно три вида пренеопластични лезии: еритроплазията на De Queyrat, еритоплазията на Bowen и Боуеновата папулоза. Тези три лезии се отнасят също като високостепенен PIN или карцино­ма in situ на пениса. Малките хистологични отлики между тези три състояния не позволяват прецизна морфологична диагноза, обосноваваща се само на хистологичните находки. Тези състоя­ния се различават основно по клиничните си изяви.Така например болестта на Боуен и боуенова­та папулоза ангажират корпуса на пениса, докато еритоплазията на De Queyrat ангажира предимно гланса или препуциума. Папулозата на Боуен се наблюдава главно при болни между 20 и 40 годишна възраст, докато болестта на Боуен се наблюдава между 30 и 50-годишна възраст. От своя страна еритроплазията на De Queyrat се среща най-често между 40и 60-годишна възраст. Случайте на прогресия към инвазивни карциноми се наблюдават по-често при еритроплазията на De Queyrat, отколкото при другите две състояния (с честота на малигнизация, варираща между 10 и 33 %). За сравнение, боуеновата папулоза почти винаги протича бенигнено, с благоприятно развитие. Дългият латентен период с HPV инфекции, индуциращи ракови заболявания, подсказва, че са налице генетични промени (дефекти) и те оказват влияние на този процес. Активирането на СRAS мутация е било открито при метастази от карцином в ингвиналните лимфни възли с доказан HPV-18 и рак на пениса. В около 40 % от случайте с кондиломи и боуенова папулоза има позитивна р53 имунореактивност, но същевременно р53 мута­ция се установява рядко при SCCP. Най-вероятно се допуска възможно взаимодействие между HPV онкопротеините с р53 като евентуален механизъм с активиране на самия р53 фактор. По-нови изеледвания показват, че са налице потискаща функция на експресията на р53 и чести мутации в същия генетичен локус при карциноми на пени­са. Лан и сътрудници съобщават за р53 имунореактивност при около 40 % от наблюдаваните кар­циноми на пениса и за липсваща такава в случаи с кондиломи и верукозна форма на карцином на пени­са, Независимо от горепредставената информа­ция все още трябва да продължи да се работи, за да се определи пряката връзка между HPV и генетичните промени при карцинома на пениса.

HPV и профилактика с ваксини
В момента се провеждат опити да се създадат ефикасни ваксини, като за тази цел се използват живи атенюирани вируси или инактивирани с формалин вируси. Тази насока създава извес­тни неудобства първо, тъй като е трудно да се изолират такива вирусни култури и второ, има потенциален риск за пренасяне върху здрави индивиди на онкогени, съдържащи се във ваксината. Използва се също u L-1 протеин с цел предизвикване образуването на антитела.

Изводи
По-задълбоченото проучване и изясняване на Е6 и Е-7 вирусни онкопротеини и техните взаимо­действия с клетъчния цикъл затвърждава мнението, че някои HPV субтипове притежават пови­шен малигнен потенциал. Досега е установено om KAUHU4HU, епидемиодогични и молекулярно-биологични проучвания, че HPV-16 и HPV-18 са основен фактор за развитието на карцином на шийката на матката. Най-сериозни доказателства за онкогенните качества на HPV в онкоурологията се откриват при карцинома на пениса. Тъй като заболяването е най-вероятно с многофакторна генеза, пребенцията и профилактиката в тази област все още нямат голям успех. Необходими са още по-задълбочена работа и проучвания, за да се установят онези генетични промени, свързани с HPV индуцираната канцерогенеза. Независимо от това срещу HPV най-вероятно ще се провежда профилактика с някои от типовете ваксини.