Брой 2/2009
Д-р Даниела Авджиева
Клиника по ендокринология, диабет и генетика, СБАЛДБ
Хромозомните аберации са една от основните причини за вродени аномалии и умствена недостатъчност. При 0,8 % от новородените се откриват бройни или структурни хромозомни аномалии. Диагностицирането на тези аберации е важно за определяне прогнозата на заболяването и за точността на генетичната консултация. Навлезлите в практиката през последните години моле- кулярно-цитогенетични методи са със значително по-висока разрешителна способност от конвенционалната цитогенетика. Целта на този обзор е да предостави опростен алгоритъм за прилагането на методите на конвенционалната и молекулярната цитогенетика при групи пациенти, които често са обект на педиатричната практика.
С хромозомни аберации са 0,8 % от новородените, като половината от тя х са с фенотип- ни прояви1. Най-честите клинични белези, подсказващи наличието на хромозомна патология, са: ♦ изоставане в нервно психическото развитие;
♦ една или повече големи мал- формации;
♦ пренатално изоставане във физическото развитие;
♦ лицев дисморфизъм;
♦ поведенчески нарушения, чест о от аутистичния спектър;
♦ абнормни дерматоглифи и трихоглифи;
♦ данни от фамилната анамнеза за родственици с умствена недостатъчност и/или вродени аномалии, множество спонтанни аборти. При конвенционалния цитоге- нетичен анализ, чрез светлинна микроскопия се изследват м етафазни и прометафазни хромозоми, обработени със специфични лентови оцветителни техники. Разрешителната способност на метода за структурни аберации е 3-4 мегабази (Mb). Най-често се изследват делящи се клетки – периферни лимфоцити, фибробласти и костен мозък. При флуоресцентната in situ хибридизация (FISH), чрез маркирани с флуоресцентно багрило ДНК сонди могат да бъдат откр и ти субмикроскопски структурни хромозомни аберации – микроделеции и микродупликации. високорезолютивната сравнителна геномна хибридизация с микрочипове (array CGH) е модерен метод за ДНК анализ, позволяващ изследването на човешкия геном с резолюция 5-10 пъти по-висока от тази на рутинния хромозомен анализ (резолюция 100-200 kb). Методът се основава на конкурентната хибридизация на алтернативно белязани тестова и контролна ДНК върху картирани и секвени- рани геномни клонове, приложени върху микрочипове в присъствие то на СоМ ДНК, която блокира повтарящите се последователности. Array CGH е чувствителен, специфичен и бърз метод за от криване на небалансирани геномни изменения, съчетаващ високата резолюция на FISH с възможността да се скринира целият геном само с една проба на конвенционалната CGH. Този метод се използва за откриване на субмикроскопски аберации, определяне на критични ДНК райони за дадено заболяване и изясняване на корелацията генотип-фенотип2. Използва се много успешно при анализ на туморни клетки и при пациенти с умствена недостатъчност и вродени аномалии3’6. Представяме ви показанията за приложение на тези три лабораторни метода при групи пациенти, които често са обект на педиатричната практика.
Хромозомни болести с познат фенотип
Началото на модерната генетика е поставено през 1959 г., когато Lejeune открива, че най-честата причина за умствена недастатъчност – синдромът на Down (1:700 раждания), е следствие на допълнителна 21-ва хромозома. През следващите две десетилетия чрез м етодите на конвенционалната цитогенетика е разкрита етиологията на множество хромозомни болести. Най- че сти те от тях, с добре познат фенотип, са: бройните аберации – синдром на Patau (тризомия 13), синдром на Edwards (тризомия 18), синдром на Turner (монозомия X) и стр уктур н и те аберации – синдром на Wolf-Hirschhorn (4р-) и синдром на котеш кото мяукане – Cri du Chat (5р-). При част от пациентите с характерен фенотип за синдромит е на Wolf-Hirschhorn и Cri du Chat (сн. 1 и 2), хромозомният анализ е нормален. в тези случаи т е са следствие на микроделеция и диагнозата може да се докаже само чрез молекулярно-цитогенетични техники (F5SH).
Микроделеционни/микро- дупликационни синдроми
Микроделеционните/микро- дупликационните синдроми са група клинично разпознаваеми заболявания, характеризиращи се с малка по размер (<5МЬ) делеция/ дупликация на част от хромозома- та, включваща множество гени, всеки от които самостоятелно допринася за фенотипната изява. За описание на тези заболявания често се използва терм инът „скачено-генен синдром", който отразява въвличането на множество функционално несвързани, но разположени в съседство един до друг гени от една хромозома. Генетичните промени при микро-делециите/микродупликациите не могат да бъдат диагностицирани чрез рутинно прилаганите лентови техники за цитогенетичен анализ. Често не могат да се визуализират дори при високорезо-лютивно лентово оцветяване на прометафазни хромозоми (разрешителни възможности 2-5 Mb), което налага използването на FISH техники. Най-честите микроделеционни синдроми са: синдром на Williams-Beuren (сн. 3), синдром на Prader-Willi (сн. 4), синдром на Angelman (сн. 5), CATCH 22 (сн. 6). Познаването на характерния фенотип на тези синдроми позволява използването на локус-специфични проби и бързо поставяне на диагнозата. Умствена недостатъчност Умственото изоставане се манифестира по време на периода на развитие (до 18 години) и се характеризира с интелектуални възможности под нормалните за възрастта и с лоша адаптация (American Psychiatric Association, 1994). Ч е с тота та на индивиди с умствена недостатъчност е 3 % от общата популация, като за тези с IQ < 50 е 0,5 %. Обединени резултати от седем скринингови проучвания показват, че чрез рутинно прилаганите лентови техники за цитогенетичен анализ, хромозомни аберации се откриват при 13,3 % от пацие н ти те с IQ < 50 и при 4,1 % при тези с IQ > 50. Изследването чрез субтеломерен FISH установява микроаберации при 6,7 % и 0,5 % съответно в тези две групи пациенти. Ав торите препоръчват като първи тест при пациенти с умствена недостатъчност да се използва конвенционалния цитогенетичен анализ7. Субтеломерните райони на хромозомите са богати на гени. Преустройства в тези райони (делеции или дупликации) по време на мейозата често водят до генетични заболявания. Според различни проучвания между 5 % и 7 % от пациентите с умствена недостатъчност и нормална кариограма са със субтеломерни преустройства8’9. Тези пациенти са с „чиста“ или синдромна умствена недостатъчност и се диагностицират чрез субтеломерен FISH или array CGH. В най-голямото проучване, публикувано до момента – скрининг чрез array CGH, се откриват небалансирани геномни изменения при 20 % от 140 изследвани деца с умствена недостатъчност, лицева дисморфия и нормален кариотип10.
Балансирани хромозомни аберации
Балансираните хромозомни аберации най-често са без фенотипна изява и могат да се предават през много поколения, без да бъдат откри ти . Носителите на подобни балансирани изменения в кариоти- па имат по-висок риск от репродуктивни несполуки. Около 6 % от индивидите с de novo възникнали видимо балансирани хромозомни преустройства са с клинична изява (малформативни стигми, умствена недостатъчност). Приема се, че тези клинични прояви са следствие от нарушаване целостта на гени, разположени в м естата на преустройство, или от наличие на малки дупликации/делеции, които не могат да бъдат откр и ти чрез светлинна микроскопия. Подходящ метод за диагностициране на по- добнй микроаберации е array CGH11 вродени аномалии
Има много малко системни проучвания за хромозомни микроаберации в големи групи пациенти със специфични вродени аномалии. Интерпретацията на наличните резултати е трудна, тъй като много често вродените аномалии са съчетани с умствена недостатъчност. вродената атрезия на слуховия канал се среща често при пациенти с хромозомни болести, особено при такива – с делеция на дългото рамо на хромозома 18. Veltman и сьтр. изследват 20 деца с изолирана атрезия на слуховия канал чрез array CGH. При всички пациенти е открита делеция с големина ~ 5 Mb, разположена на дългото рамо на хромозома 18 (18q22.3-q23) – кандидат район за гена на вродената атрезия на слуховия канал12. Чрез array CGH е открита дупликация в 8р22-23.1 при няколко пациенти с клинична диагноза „синдром на Kabuki“, което е важна стъпка към изясняване е ти ологията на това заболяване13.
Ограничения на array CGH
Array CGH е чувствителен, специфичен и бърз метод за откриване на небалансирани геномни изменения, но има и някои недостатъци:
♦ не открива аберации, които не водят до небалансирани геномни изменения (балансирани хромозомни транслокации, инверсии, полипло- идии);
♦ ограничени възможности за от криване на мозаицизъм; преустройства, засягащи 50 % от клетките са границата, която може да бъде открита;
♦ полиморфизми по отношение броя копия в популацията, затрудняват интерпретацията на получените резултати;
♦ все още скъп и труднодостъпен за масово приложение метод. въпреки тези ограничения на метода, се очаква през следващите няколко години то й коренно да промени разбирането ни за вродените заболявания и да представи в нова светлина този стар проблем
Литература: 1. Gardner RJM, Sutherland GR. Chromosome abnormalities and genetic counselling. New York: Oxford University Press, 1996. 2. Ooslander AE, Meijer G, Ylstra B. Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics. Clin. Genet. 2004; 66(6): 488-495. 3. Menten B., Maas N., Thienpont b., Buysse k. et al. Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalance in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of published reports. J.Med. Genet. 2006; 43; 625-633 4. Shaw-Smith C, Redon R., Rickman L., Rio M. et al. Microarray based comparative genomic hybridization (orray-CHG) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J.Med.Genet.2004; 41; 241-248 5. Shoumans J., Ruivenkamp C, Holmberg E. et al. Detection of chromosomal imbalances in children with idiopathic mental retardation by array based comparative genomic hybridization (array-CGH). J.Med.Genet. 2005; 42; 699-705 6. Dimova I., Vazharova R., Nikolova D., Tincheva R., Nesheva D., Uzunova Y, Toncheva D. Whole genome analysis by array-based comparative genomic hybridization in patients with congenital malformations. BJMG 2008; 11(1): 33-39. 7. van Karnebeek CD, Jansweijer MC, Leenders AG, et al. Diagnostic investigations in individuals with mental retardation: a systematic literature review of their usefulness. EurJHum Genet 2005;13:6-25. 8. Xu j, Chen Z. Advances in molecular cytogenetics for the evaluation of mental retardation. Am J Med Genet C Semin Med Genet 2003;117:15-24. 9. Knight SJ, Flint J. Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis. J Med Genet 2000; 37: 401-409 10. Menten B., Maas N., Thienpont B., Buysse K. et al. Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalance in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of published reports. J.Med. Genet. 2006; 43; 625-633 11. Gribble SM, Prigmore E, Burford DC, Porter KM, The complex nature of constitutional de novo apparently balanced translocations in patients presenting with abnormal phenotypes. J Med Genet 2005;42:8-16. 12. Veltman JA, Jonkers Y, Nuijten I et al. Definition of a critical region on chromosome 18 for congenital aural atresia by array CGH. Am J Hum Genet 2003: 72 (6): 1578-1584. 13. Milunsky JM, Huang XL. Unmasking Kabuki syndrome: chromosome 8p22-8p23.1 duplication revealed by comparative genomic hybridization and вАС-FISH. Clin Genet 2003:64:509-516.