Брой 12/2008
Д-р Мария Атанасова
Катедра по микробиология и имунология, МУ Пловдив
Туберкулозата съпътства човешкото общество от античността. В кости от египетски мумии от 3000 г. пр.н.е. са открити доказатедства за туберкулозна инфекция. Поради разнообразната симптоматика заболяването е обособено като самостоятелна нозологична единица едва през 1820 г., а неговият причинител Mycobacterium tuberculosis, е открит през 1882 г. от Робърт Кох. По това време (XIX и начадото на XX век) туберкулозата е ендемична сред бедното градско население и една от най-честите причини за смърт. През 1815-1818 г. един от четири смъртни случая в Англия, съответно един от шест във Франция, се дължат на туберкулоза. През XX век жертвите на тази инфекция са 100 милиона.
Откритието на Р. Кох е ключов момент в изучаване на туберкулозата, защото поставя началото на разработването на методи за етиологичната й диагностика. „Златен“ стандарт и в диагноза до днес остава култивирането на причинителя от проби на пациента (най-вече храчки, но също гной, ликвор, тъканна биопсия, кръв и др.) при използване на класическите хранителни среди на ЛьобенщайнЙенсен или Мидълбрук. Туберкулозните бактерии се развиват при аеробни условия и леко кисело pH, като образуват много характерно грапави белезникави колонии, приличащи на трохички хляб или цветно зеле. Култивирането на туберкулозни бактерии е наложително, ако в пробите се открият киселинноустойчиви микроорганизми при микроскопиране на оцветени по метода на Цил-Нилсен препарати. По този метод микробактериите изглеждат много типично рубинено-червени пръчици, често групирани, на фона на синьо оцветени киселиннонеустойчиви бактерии и клетъчни елементи. По принцип обаче, микроскопията има само ориентировъчно значение в микробиологичната диагностика.
Недостатък на културелния метод за диагноза на туберкулозата е значителната бабност на растежа на микобактериите, в резултат на което култура се поябяба едба на трета-четвърта седмица от посябката. Тоба се дължи на дългото генерационно време на микроорганизма, който се дели веднъж на 15-20 часа, за разлика от побечето патогенни за чобека бактерии, при които деление настъпба на всеки 15-30 минути и колониите стабат видими още след 24 часа.
За бърза лабораторна диагностика на туберкулозата са разработени различни ноби подходи. Един от тези подходи се базира на продукцията на интерферон-гама (IFN-y) от лимфоцитите на пациента, в резултат на стимулирането им със специфични за Mycobacterium tuberculosis антигени. Създадените на тази основа гпестобе станаха избестни като IGRAs [lnterferon-y (interferon-gamma) release assays тестове с отделяне на интерферон-гама]. Техен предстабител е QuantiFERON®-TB Gold (QFN-G), продукт на абстралийската фирма Cellestis.
Разработването на QFN-G теста става възможно след разшифроване генома на туберкулозния бактерий. Това води до откриване на специфичните имунодоминантни антигени на Mycobacterium tuberculosis ESAT-в (early secreted antigenic target), CFP-10 (culture filtrate protein 10) и TB7.7(p4). Те ca кодирани от RD1 региона на туберкулозния бактерий и отсъстват от живия ваксинален щам BCG, както и от повечето други представители на род Mycobacterium, (наречени още нетуберкулозни или атипични микобактерии, например Mycobacterium avium complex). Използването на тези антигени в QFN-G теста обуславя неговата висока специфичност. Индивидите, инфектирани с Mycobacterium tuberculosis, имат обикновено в кръвта си лимфоцити, които разпознават тези, както и други микобактериални антигени. Процесът на разпознаване индуцира образуване и секреция на цитокина IFN-y. Именно откриването и последващото количествено определяне на IFN-y е целта на QFN-G. Техническото изпълнение на теста става с цяла кръв, взета от пациента. Тя се поставя в специална епруветка (Тв), съдържаща пептиден коктейл, който имитира горепосочените имунодоминантни туберкулозни антигени. Следва инкубация на 37 °С за 18-24 часа време, необходимо за контакт на туберкулозните антигени с лимфоцитите и секреция на IFN-y. Кръв от пациента се поставя и в т. нар. нулева епруветка, която не съдържа туберкулозни антигени и служи за отрицателна контрола; тя се третира по същия начин. След инкубацията епруветките се центрофугират, плазмата се отдела и количеството IFN-y се измерва с ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ензимно сбързан имуносорбентен тест). QFN-G тестът се счита за положителен, когато количеството IFN-y в Тв епруветката е значително над стойността на IFN-y в нулевата епруветка. Измерването на IFN-y става в IU/ml.
Пробедени са многобройни изследвания върху качествата на QFN-G теста, при които той е сравняван с най-широко използвания до момента метод за първичен скрининг при съмнение за туберкулоза туберкулиновия кожен тест на Манту.
Пробата на Манту отчита алергичната реакция от бавен тип, която се развива у инфектирания с Mycobacterium tuberculosis индибид.
Първоначално като алерген е използван туберкулинът глицеринов екстракт от туберкулозни бактерии, създаден от Р. Кох. впоследствие от него е отделена само протеиновата фракция, която е отговорна за реакциите на свръхчувствителност и е получен PPD (Purified protein derivative пречистен протеинов дериват), който се използва и до днес в пробата на Манту. При нея стандартна доза от 5 TU (туберкулиноби единици) (0,1 ml) PPD се инжектира интрадермално на предмишницата и се отчита след 48-72 часа. Лице, което е имало експозиция на туберкулозни бактерии, се очаква да прояви имунна реакция в кожата, съдържаща бактериалните протеини. Кожната алергична реакция от бабен тип се измерва чрез диаметъра на полученото кожно уплътнение (индурация) в милиметри. Еритемът не се взема предвид. Резултатите от пробата на Манту се интерпретират твърде различно. Общо взето в страни, в които не се прави BCG ваксинация, размер до 5 мм е отрицателен резултат, 8-10 мм съмнителен, а над 10 мм положителен.
Основен недостатък на пробата на Манту е, че тя се позитивира и при лица, имунизирани с живата протиботуберкулозна ваксина BCG, поради общи антигени на Mycobacterium tuberculosis и ваксиналния щам, произхождащ от Mycobacterium bovis. Това намалява диагностичната стойност на пробата на Манту в региони, където BCG ваксината се прави задължително, както е в България. От друга страна, туберкулинобата проба показва и слаба чувствителност, може да бъде и фалшиво отрицателна в случаи на дисеминирана туберкулоза, при болни от СПИН, при имуносупресирани болни, при лечение с кортикостероиди и др. Не е без значение и субективното отчитане на пробата.
Редица недостатъци на туберкулиновия кожен тест на Манту са преодолени при QFN-G теста. Преди всичко QFN-G не се влияе от предшестбаща BCG ваксинация1, както и от повечето други (атипични) микобактерии, тъй като използваните в QFN-G пептидни антигени индуцират синтеза на IFN-y в Т-лимфоцитите само на пациенти, инфектирани с Mycobacterium tuberculosis, но не и при неинфектираните. За разлика от Манту теста,
QFN-G изисква само една визита на пациента и е по-прецизен, защото се контролира лабораторно. Резултатите са обективени и възпроизводими, и не са предмет на интерпретация, базирана на допълнителни данни (напр. рискови фактори експозиция и др.). При това резултатите са налице в рамките на 24 часа.
QFN-G е сигнификантно no-чувсвбителен и специфичен от Манту-теста, и подпомага по-ранната клинична диагноза на активната туберкулоза преди още да са налице бактериологичните разултати, (които се получават след 3-в седмици култивиране), а тоба позволява по-рано да се започне терапията2. В обратния аспект с QFN-G теста се избягват фалшиво положителните резултати на туберкулиновия кожен тест, а следователно се избягва и ненужно лечение с туберкулостатици, респективно спестяват се средства, както и експозиция на токсични медикаменти.
Съобщения от региони с различна ендемичност за туберкулоза анализират диагностичните възможности на новия метод. QFN-G е ефективен за диагноза както на активна пулмонарна, така и на екстрапулмонарна туберкулоза3. Особено много се акцентира на високата чувствителност на този тест при откриване на латентна туберкулозна инфекция у деца4 и бъзрастни5. Такъб скрининг позболява ранна терапия и превенция на разбитието на активна туберкулозна инфекция. в изследване на лица с различна степен на експозиция на Mycobacterium tuberculosis QFN-G, тестът е оценен като по-добър индикатор (от Мантутеста) за риска от развитие на туберкулоза у BCG ваксинирана популация8. Получени са данни за бързо и коректно откриване и на перинаталната туберкулоза7. Последната е проблематична за диагностициране, поради неспецифично представяне, трудно получаване на микробиологична верификация (от стомашен аспират) и ненадеждни Манту-тестове.
QFN-G е използбан с успех и е препоръчителен за идентифициране на фалшиво позитивни Манту-тестове при деца8.
По данни на СЗО туберкулозата засяга около 1/3 от световната популация. Годишно се регистрират приблизително 9 милиона нови заболявания. На тази инфекция се дължат около 2 милиона смъртни случая всяка година; водеща причина е за летален изход при бодните от СПИН. Появата и разрастването на СПИН епидемията, както и неглижирането на програмите за контрол на туберкулозата, доведоха до възвръщане на това заболяване след 1980 г. Особено тревожна е появата на резистентни туберкулозни щамове, чието разпространение нараства след 1998 г. в тази връзка се изтъква ползата от QFN-G теста като потенциално средство за мониторинг на антитуберкулозното лечение, тъй като се установява, че тестът се негативира в хода на лечението, отразявайки по този начин ефикасността му5. С това QFN-G може да бъде подходящ за разкриване на пациенти, които не отговарят на терапията и за които се налага индибидуализиране на прилаганите антитуберкулозни средства.
В заключение винаги трябба да се взима под внимание, че диагностиката на туберкулозата не бива да се основава на един единствен метод. Положителният QFN-G тест безспорно подкрепя диагнозата, но негативният QFN-G резултат не е основание за изключване на туберкулоза, особено при наличие на клинични симптоми. в подобни случаи са необходими и други диагностични критерии за потбърждабане или изключбане на заболябане като не забравяме, че окончателна верификация дава културелният метод.
Несъмнено е обаче, че QFN-G тестът съществено подобрява диагностиката и е крачка напред в контролирането на туберкулозната инфекция.
Литература:
1. QuantiFEROhf-TB Gold in the Diagnosis of Active Tuberculosis
Bartu V, Havelkova M, Kopecka E
J Int Med Res. 200в; 3в: 434-7
2. Usefulness of whole-blood interferon-y assay and interferon-y enzyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis.
Kang YA, Lee HW, Hwang SS, Um SW, Han SK, Shim YS, Yim JJ
Chest. 2007 132: 959-в5.
3. Discrepancy Between the Tuberculin Skin Test and the Whole-Blood Interferon Gamma Assay for the Diagnosis of Latent Tuberculosis Infection in an Intermediate Tuberculosis Burden Country
Young Ae Kang, Hye Won Lee, Ho II Yoon, BeLong Cho, Sung Koo Han,
Young-Soo Shim, Jae-Joon Yim.
JAMA 2005: 293; 275в 27в1
4. Risk for Tuberculosis among Children
Hiroshi Nakaoka, Lovett Lawson, S. Bertel Squire, Brian Coulter, Pernille Ravn, Inger Brock, C.Anthony Hart, and Luis E. Cuevas
Emerg Infect Dis 200в; 12:13в3-в
5. Usefulness of Interferon-gamma-based Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis Infection in Childhood Tuberculosis
Mori M, Kurosawa R, Imagawa T, Katakura S, Mitsuda T, Aihara Y, Yokota S.
Kansenshogaku Zasshi 2005; 79: 937-
944.
в. Prospective Comparison of the Tuberculin Skin Test and 2 Whole-Blood Interferon-y Release Assays in Persons with Suspected Tuberculosis
Gerald H. Mazurek, Stephen E. Weis, Patrick K. Moonan, Charles L. Daley, John Bernardo, Alfred A. Lardizabal, Randall R. Reves, Sean R. Toney, Laura J. Daniels and Philip A. LoBue
Clin Infect Dis 2007; 45:в37-45.
7. Accuracy of an interferon-y release assay to detect active pulmonary and extrapulmonary tuberculosis
T. Nishimura, N. Hasegawa, M. Mori, T. Takebayashi, N. Harada, K. Higuchi, S.Tasaka, A. Ishizaka
Int J Tuberc Lung Dis 200в; 12: 2в974.
в. Use of QuantiFERON®-Тв Gold test in the investigation of unexplained positive tuberculin skin tests
E. Nsutebua, S.J. Moffittb, C. Mullarkeyc, M.S. Schweigera, T. Collynsd, J.P. Watson b
Public Health. 200в May 15.
