Ултраструктурни промени при Сryptococcus neoformans под влияние на НСПВС

Брой 12/2008

Е. Христозова*, И. Дръндарска2, С. Николаева2, Т. Кантарджиев2 1
Катедра по микробиология и имунология, МУ Пловдив 2
Национален център по заразни и паразитни болести София

Резюме.

Дрожди от род Cryptococcus причиняват опортюнистични инфекции в имунокомпрометирани пациенти. Има данни за ултраструктурни промени на клетъчната стена на дрожди от род Candida след въздействие с нестероидни противовъзпалителни средства (НСПВ). Целта на настоящето изследване е да се установят адекватни промени под влияние на Ibuprofen при дрожди от род Cryptococcus. Проучени са щамове криптококи от колекция и изолат от пациент. Установени са ултраструктурни промени в организацията на клетъчната стена на дрожди от род Cryptococcus. Разширени са познанията относно антифунгалната активност на Ibuprofen спрямо Cryptococcus neoformans.

Въведение

Криптококите са повсеместно среицани дрождоподобни гъбички, причиняващи опортю­нистични инфекции в имунокомпрометирани пациенти. Най разпространеният предстабител Cryptococcus neoformans е отго­ворен за третата по честота системна микоза. Освен това през последните години се отчита нарастване броя на имунокомпрометираните пациенти1. Това налага широката употреба на антифунгални средства за профилактика и терапия на заболяванията, породени от етиологичните причинители на микози. Продължителното им приложение обаче, след различно дълъг период от време, довежда до култивиране на устойчиви щамове2. Ето защо е особено актуално търсенето на нови възможности за адекватна терапия със средства, притежаващи антифунгална активност. Известно е, че редица неантибиотични медикаменти притежават подобна активност. Такива са някои диуретици, психотерапебтици, нестероидни противовъзпалителни средства, антидиабетици, p-блокери3’4. Има данни за антифунгална­та активност на нестероидното протибовъзпалително средство Ibuprofen, спрямо кле­тъчната стена на Candida5. Целта на нашето проучване е да се разширят познанията за антифунгалната активност на Ibuprofen и да се даде информация за активността му срещу дрожди от род Cryptococcus и по-специално Cryptopcoccus neoformans.

Материали и методи

Щамове

Използвани бяха 2 щама от род Crypto­coccus: С. neoformans — CIP 3в от колекция на Институт „Пастьор“, Франция и С. neo­formans # 81 клиничен изолат от лумбален ликвор на СПИН болен пациент, колек­ция на НЦЗПБ, София. За целта дрождите бяха субкултивирани двукратно на Сабуро агар (Difco Laboratories) за 24 ч. на 35 °С и ресуспендирани във физиологичен разтбор до 1 -5 х 105 клетки/мл (клетки в стацио­нарна фаза).
Антифунгален агент Като антифунгален агент бе използван Ibuprofen (alfa-methyI-42-methulopropylbenzenacetic acid) на Sigma.

Инкубация на дрождите

24-часова култура на дрождите в стационарна фаза се суспендира във физиоло­гичен разтвор и се ресуспендира в 10 тМ HEPES буфер (pH 7.2), обогатен с 2 % глюкоза. И двата щама С. neoformans се третират за 24 часа на 35 °С с 12.5, 50 и 100цт/т1 концентрации на Ibuprofen. в края на инкубационния период дрождите се центрофугират за 10 мин. на 1в00 RPM .

Електронна микроскопия

Третирани и нетретирани с Ibuprofen клетки са обработени за ултраструктурен анализ по стандартна мето­дикав7. Тъй като дрождевите клетки са с ригидна клетъчна стена, е трудно да се фиксират по конвенционалните методи, затова се използва фиксатор глутаралдехид 2.5 % в Милиониг буфер, pH 7.2, центрофугирано за 70 минути на 15 000 RPM, последвано от постфиксирано в осмиев четириокис за 4 часа. След последващо каскадно дехидратиране материалите преминават през пропилен оксид и се в ключват в дуркопан. Ултратънки срези са получени на LKB Ultratome микротом и са контрастирани с уранил аце­тат, последвано от оловен нитрат. Наблюденията и микрографиите са извършени с електронен микро­скоп ТЕМ J-100C при различни увеличения и ускоряващо напрежение 80 kV.

Резултати

Ibuprofen потиска растежа на проучваните щамове С. neoformans. При ниски концентрации от 12.5 цд/ ml се наблюдава частично, докато при 50 и 100 jug/ml има съществено и пропорционално намаление на микробното число, в сравнение с нетретираните щамове.
Клетките на С. neoformans CIP 3в, култивирани на среда без Ibuprofen показват типичната структу­ра на дрожди, расли в сре­да, в присъствието на глю­коза. Клетъчната стена и цитоплазмената мембрана са отчетливи и ясно изразени. Има добре обособено ядро, малък брой митохондрии с нормадна големина и овална форма. Някои от клетките са в делене.
в електронно-микроскопските наблюдения на клетки, третирани с ниски дози показбат изобилие от бактериални тела, които са източени и обоидни, липсба фибрилерен слой, зонално-глобуларни със средна електронна плътност натрупвания, създабащи впечатление за нерабност, зонално-полюсно фибрилерни окръгляния, нишковидни структури, умерено-плътен ламинарен слой, изграден от редуващи се светли и тъмни зони, като на места има разцепване и раздалечаване на ламините.
При високи дози се виждат единични клет­ки с неясно очертана клетъчна стена без фибрилерен слой, със петниста цитоплазма, цитоплазма с електронно-плътни и светли зони, показващи белези на начална цитоли­за.
Клетки на С. neoformans — в клиничен изолат # в1, третиран с ниски дози Ibuprofen, се наблюдават единични клетки с фибрилерна капсула, дебел, плътен, електронно-плътен слой и двуслойна клетъчна мембрана.

При средни дози Ibuprofen (Е # 20 в3 32в) има окръглени дрождеби клетки с очертана фибрилерна външна зона с радиерно изхождащи тънки, дълги и къси нишки, на места
– с нодуларни задебелябания и формиране на мрежа. Под тях има тънък електронноплътен слой с дебелина 0.19в цм, на места
— с просбетлявания, последбан от сбетла зона двуслойна и невинаги ясно очертана. Цитоплазмата е с участъци на просветлявания и кондензация с мезозоми и вакуоли.

При С. neoformans # 81 клиничен изолат при третиране с висока дози Ibuprofen се наблюдават единични клетки обоидни, кръгли или бъбрековидни, тънка електронно-плътна клетъчна стена с единични къси, дебели, на широка основа,нишковидни екструзии.

Дискусия

Откриването и прилагането на нови антифунгални средства продиктува необходимостта от извършването на настоящото проучване. Ibuprofen като нестероидно противовъзпалително средство е известен с антифунгалната си активност срещу С. albicans. Механизмът на фунгистатичност и фунгицидност се дължи на липофилния му характер, който е в съответствие с високия коефициент октанол/вода на препара­та. Hue установихме растежно инхибиране, придружено от ултраструктурни промени в цитоплазмата и клетъчната стена на криптококи CIP 3в и клиничен изолат # в1.
При ниски конценрации и при двата щама се наблюдават начални изменения в ултраструктурната организация; при средни дози — настъпват видими изменения както в кле­тъчната стена, така и при вътреклетъчните органели, докато при високи дози има категорични данни за необратими клетъчни промени и цитолизис.

Концентрацията на Ibuprofen в кръвта след приемането на стандартни дози НСПВ е малко no-ниска от използваните в това проучване, които се доближават до токсичните за макроорганизма. Получените данни показват необходимостта от задълбочени изследвания на антифунгалната активност на Ibuprofen в комбинация с антифунгални агенти, както е известно при Candida. Препаратът би могъл да се използва за локално третиране на кожни локализации на криптококоза много поефективно, отколкото ако е приложен сис­темно, което предлага допълнителни възможности за лечение на криптококовите инфекции.

Литература

1. Casadevall, A. and Perfect J.R., 199в. Cryptococcus neoformans, Washington DC: American Society for Microbiology Press.
2. Denning, D.W, 1995. Can we pre­vent azole resistance in fungi? Lancet , 34в, 454-455.
3. Ceberlund, H. and Mardh P-A. 1993. Antibacerial activities of non-antibiotic drugs, J Antibicrob Chemother,
32, 355-3в5.
4. Ceberlund, H. and Mardh P-A. 1993. Antibacerial activities of N-acetylcysteine and some non ste­roid antiinflamatory drugs. J Antibicrob Chemother, 32, 903-904.
5. Pina-Vaz, C., Sansonetty, F., Rodrigues, A., De-Olivera, M., Fonseca, A.and Mardh P.A., 2000. Antifungal activity of Ibuprofen alone and in combination with Fluconazole
against Candida, J Med Micribiol, 49,
в31-в40.
в. Edwards, M., Gordon M., Lapa E., Ghiorse W, 19в7. Micromorfology of Cryptococcus neoformans. J Bacteriol,
94, 7вв-777.
7. Sakaguchi, N., Baba T, Fujuzawa, M., Ohno S. 1993. Ultrastructural study of Cryptococcus neoformans by quick freezing and deep-etching method. Mycopathologia, 121, 131-141.